Simultaneous determination of aspirin and salicylic acid in water by high performance liquid chromatography with UV detection after pre-concentration by solid phase extraction (SPE)

Wstęp

Kwas acetylosalicylowy (aspiryna) jest powszechnie stosowany w lecznictwie, jako lek przeciwbólowy, przeciwzapalny, przeciwgorączkowy i w profilaktyce przeciwzakrzepowej. Od 120 lat jest najczęściej sprzedawanym lekiem na świecie (bez recepty) dostępnym pod różnymi nazwami (np. Aspirin, Polopiryna, Upsarin). Maksymalna dawka dobowa (MDD; ang.: Maximum Daily Dose) przy podaniu doustnym została ustalona na poziomie 4,0 g dla dorosłych oraz 1,5 g dla młodzieży powyżej 12 roku życia [1].

Zaliczany do niesteroidowych leków przeciwzapalnych kwas acetylosalicylowy jest substancją czynną, wrażliwą na czynniki hydrolityczne, jednak niezależnie od czynnika powodującego degradację, ścieżek rozkładu, metabolizmu oraz mechanizmów reakcji, finalnym produktem jego rozpadu jest kwas salicylowy – związek toksyczny dla ludzi i niebezpieczny dla środowiska. W związku z powszechnym stosowaniem kwasu acetylosalicylowego oraz jego właściwościami chemicznymi istnieje potencjalne zagrożenie zanieczyszczenia tym związkiem i produktami jego rozkładu wód powierzchniowych ujmowanych na potrzeby zaopatrzenia ludności w wodę przeznaczoną do spożycia i w mniejszym stopniu wód podziemnych.

Wyniki badań potwierdzają, że ścieki komunalne zawierając pozostałości leków mogą być istotnym źródłem zanieczyszczenia środowiska [2]. Wykryte w ściekach pozostałości środków farmaceutycznych, z uwagi na swoistą aktywność biologiczną, należy zaliczyć do związków potencjalnie niebezpiecznych szczególnie dla środowiska wodnego. Proces oczyszczania ścieków nie usuwa całkowicie tych związków i mogą one w postaci niezmienionej lub pośrednich metabolitów przedostawać się do środowiska wodnego. Ponadto szacuje się, że pozostałości leków mogą ulegać kumulacji w organizmach żywych [3]. W wodach powierzchniowych rzek z terenu Polski (Odra, Warta) kwas acetylosalicylowy i kwas salicylowy oznaczono na poziomach odpowiednio z zakresów 0,3-0,7 μg/l i 0,1-0,2 μg/l [4].

Obecność pozostałości leków (w tym aspiryny) w wodzie nie podlega monitoringowi w ramach Dyrektywy Rady 98/83/WE z dalszymi zmianami [5,6] oraz Rozporządzenia Ministra Zdrowia z dnia 7 grudnia 2017 roku w sprawie jakości wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi [7], a w związku z tym nie ustalono najwyższego dopuszczalnego stężenia tego związku w wodzie przeznaczonej do spożycia. Chociaż jest on relatywnie mało toksyczny (LD50 dla myszy i szczura przy podaniu doustnym wynosi odpowiednio 1,1 g/kg m.c. i 1,5 g/kg m.c. [8]) to jego produkt hydrolizy – kwas salicylowy jest związkiem bardziej toksycznym (LD50 dla myszy 500 mg/kg m.c. [9]).

Celem pracy było opracowanie i zwalidowanie czułej metody jednoczesnego oznaczania kwasu acetylosalicylowego (aspiryny) i kwasu salicylowego w wodzie techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detekcją w zakresie ultrafioletu po wstępnym zatężaniu analitów z wykorzystaniem ekstrakcji do fazy stałej (SPE) oraz analiza pilotażowych próbek wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi.

Aparatura

Do oznaczeń kwasu acetylosalicylowego (ASP) i kwasu salicylowego (SAL) zastosowano wysokosprawny chromatograf cieczowy Summit PAN (Dionex, Niemcy) sterowany oprogramowaniem Chromeleon. Do rozdzielenia analitów zastosowano kolumnę nowej generacji Develosil XG-C30M (150×4,6 mm, 3 μm), firmy Nomura Chemical Co. Ltd. wraz z przedkolumną ochronną o takim samym wypełnieniu (10×4,6 mm).

Etap oznaczania poprzedzony był etapem zatężania ASP i SAL za pomocą ekstrakcji do fazy stałej na kolumienkach SPE (ang.: Solid Phase Extraction) typu Oasis HLB (ang. Hydrophilic Lipophilic Balance) wypełnionych kopolimerem N-winylopirolidonu z diwinylobenzenem – 500 mg/ 6 ml (Waters, USA).

Opis zoptymalizowanej metody jednoczesnego oznaczenia kwasu acetylosalicylowego (aspiryny) i kwasu salicylowego w wodzie techniką HPLC-PDA

Badano możliwość jednoczesnego oznaczania kwasu acetylosalicylowego i kwasu salicylowego w wodzie podczas jednego procesu analitycznego przy użyciu detektora z matrycą diodową PDA (ang.: Photodiode Array). Przeprowadzono optymalizację parametrów aparaturowych i rozdzielania chromatograficznego. Badano stabilność analitów i uzyskiwane czułości w zależności od składu, przepływu i temperatury fazy ruchomej. Do rozdzielania ASP i SAL zastosowano kolumnę Develosil XG-C30M (150×4,6 mm, 3 μm) przy objętości wstrzykiwanej próbki – 30 μl. Skład fazy ruchomej obejmował acetonitryl i 0,1% wodny roztwór kwasu ortofosforowego (375:625, v/v), przy przepływie 0,9 ml/min w temperaturze 20°C. W tych warunkach czas retencji ASP wynosił 3,8 min, natomiast SAL – 5,1 min (detekcja przy długości fali UV – 210 nm). Kalibracje przeprowadzano w zakresie stężeń 100-500 ng/ml (ASP i SAL). Do przyrządzania roztworów kalibracyjnych stosowano wzorzec aspiryny o czystości 99,4% (Fluka Analytical / Sigma-Aldrich, USA) i kwasu salicylowego o czystości 99,96% (Sigma-Aldrich, USA).

W celu obniżenia uzyskiwanych granic oznaczalności, kwas acetylosalicylowy i kwas salicylowy obecne w próbce wody były zatężane za pomocą ekstrakcji do fazy stałej na kolumienkach SPE (ang.: Solid Phase Extraction) typu Oasis HLB (ang. Hydrophilic Lipophilic Balance) wypełnionych kopolimerem N-winylopirolidonu z diwinylobenzenem – 500 mg/ 6 ml (Waters, USA). Kolumienki SPE kondycjonowano za pomocą porcji metanolu o objętości 6 ml, a następnie dwóch porcji wody dejonizowanej uzyskanej w systemie Simplicity 185 (SAS Millipore, Francja) o objętościach 6 ml, przy czym nie dopuszczano do przesuszenia złoża. Po etapie kondycjonowania próbki wody o objętościach 0,5 l przepuszczano przez kolumienki SPE z przepływem nie większym niż 3 ml/min (ok. 1 kropla/s), kontrolując podciśnienie 12-pozycyjnego systemu SPE-12G (J.T. Baker, USA) poprzez regulację położeń zaworów króćców z PTFE oraz zaworu głównego sprzężonego z manometrem. Po przepuszczeniu całych próbek wody przez kolumienki SPE, odwirowywano pozostałość wody ze złóż z prędkością 4000 obrotów/min przez 10 minut, a następnie stosowano suszenie pod próżnią. Anality wymywano z kolumienek do odbieralników za pomocą czterech porcji dimetoksymetanu (DMM) o objętościach 1,0 ml. Po odparowaniu DMM suchą pozostałość rozpuszczano w 1 ml fazy ruchomej i przelewano do szczelnie zakręcanych naczynek szklanych automatycznego podajnika próbek. Przygotowana w wyżej opisany sposób próbka była poddawana analizie za pomocą techniki HPLCPDA w układzie izokratycznym.

Wyniki i dyskusja

Kalibracje w zakresie stężeń 100-500 ng/ ml (ASP i SAL) charakteryzowały się współczynnikami korelacji wynoszącymi 0,9988 (ASP) i 0,9994 (SAL). Wyznaczone granice wykrywalności i oznaczalności ASP oraz SAL (bez etapu zatężania analitów z próbek wody) wynosiły odpowiednio: 1,0 ng/ml i 2,0 ng/ml oraz 2,7 ng/ml i 5,4 ng/ml.

W przypadku zastosowania wstępnego etapu zatężania analitów uzyskane granice wykrywalności i oznaczalności ASP oraz SAL wynosiły odpowiednio: 7 i 14 ng/l oraz 14 i 28 ng/l. Średnie odzyski wynosiły 82% (ASP) i 73% (SAL), przy uzyskiwanej poprawności metody do 20%, natomiast precyzja (RSD) wyznaczona na poziomie 200 ng/l ASP i SAL odpowiednio 3,4% i 2,3%.

Przy zastosowaniu zoptymalizowanych warunków przedstawionych w tabeli 1 czasy retencji sygnałów wzorców aspiryny (ASP) i kwasu salicylowego (SAL) wynosiły odpowiednio 3,8 min i 5,1 min.

Typowe wykresy kalibracyjne kwasu acetylosalicylowego i kwasu salicylowego przedstawiono odpowiednio na rys. 1 i rys. 2.

Wyznaczanie stężeń oznaczanych analitów w próbkach wody odbywało się poprzez zastosowanie funkcji kalibracji opartych na regresji liniowej pierwszego stopnia. Do obliczeń stosowane były pola powierzchni sygnałów analitów. W celu przeliczenia oznaczonych stężeń analitów w próbkach wody po zatężeniu metodą SPE wyrażonych w ng/ml na zawartości analitów w pobranych do analizy próbkach wody wyrażonych w ng/l uwzględniano współczynniki przeliczeniowe odzysków (α = 100%/W%) – obliczone na podstawie wyznaczonych wartości średnich odzysków (W%) oraz współczynnik wynikający z procedury zatężania próbek (WYNIK [ng/l] = wynik [ng/ml] · 2α).

Próbki wody do badań pobierano do butelek ze szkła oranżowego oraz transportowano i przechowywano do momentu analizy w temperaturze 4oC±2,5oC, zabezpieczając przed działaniem światła, nie dłużej niż 24 godziny od momentu ich pobrania.

Próbki wody przeznaczonej do spożycia pobrano w grudniu 2017 roku z kranów konsumentów ze strefy zaopatrzenia Zakładu Wodociągu Centralnego w Warszawie.

Na rysunku 3 przedstawiono chromatogramy: próbki wody przeznaczonej do spożycia po zatężaniu ww. związków za pomocą techniki SPE i roztworu kalibracyjnego kwasu acetylosalicylowego i kwasu salicylowego (100 ng/ml). W badanych próbkach wody nie stwierdzono obecności ww. analitów na wyższych poziomach niż odpowiadające granice oznaczalności.

Table 1.
Optimized chromatographic separation and apparatus parameters of the method based on HPLC-PDA technique
Figure 1.
Calibration graph of ASP performed in the concentration range up to 500 ng/ml
Figure 1.
Calibration graph of SAL performed in the concentration range up to 500 ng/ml
Figure 3.
Chromatogram of a sample of water intended for consumption obtained by preliminary concentration of analytes using the SPE technique – A and a chromatogram of a calibration solution with ASP and SAL concentrations of 100 ng/ml – B

Wnioski

Opracowana metoda pozwala na jednoczesne oznaczanie kwasu acetylosalicylowego (ASP) i kwasu salicylowego (SAL) w wodzie techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detektorem z matrycą diodową (HPLC-PDA).

Zastosowanie wstępnego etapu zatężania tych związków za pomocą ekstrakcji do fazy stałej SPE umożliwiło obniżenie granic oznaczalności tych związków o ponad dwa rzędy wielkości do poziomów: 14 ng/l (ASP) i 28 ng/l (SAL), przy uzyskiwanych odzyskach powyżej 70% i poprawnością oznaczeń nie gorszą niż 20%.

W badanych próbkach wody przeznaczonej do spożycia pobranej ze strefy zaopatrzenia Zakładu Wodociągu Centralnego w Warszawie nie stwierdzono obecności kwasu acetylosalicylowego i kwasu salicylowego na poziomach wyższych niż ww. granice oznaczalności. Przeprowadzone badania potwierdzają znikome narażenie ludzi na te związki występujące w wodzie przeznaczonej do spożycia uzyskiwanej w zakładzie wodociągowym stosującym zaawansowane procesy uzdatniania (w tym sorpcję na węglu aktywnym).

Podziękowania

Praca została sfinansowana w ramach tematu badawczego „Narażenie na czynniki chemiczne występujące w środowisku człowieka” – projekt 7/ZŚ.2. „Badanie zawartości kwasu salicylowego w wodzie jako finalnego produktu degradacji kwasu acetylosalicylowego” realizowanego w latach 2016-2017.

L I T E R AT U R A

[1] Pharmindex Brevier – Podręczny Indeks Leków 2007/2, CMP Medica Poland, Warszawa.

[2] U. Kotowska, M. Jasińska. Analiza jakościowa śladowych zanieczyszczeń organicznych w ściekach komunalnych z miast północnowschodniej Polski. Inżynieria i Ochrona Środowiska 14 (3), 2011, 223-232.

[3] A. Koszowska, M. Ebisz, T. Krzyśko-Łupicka, Obecność farmaceutyków i środków kosmetycznych w środowisku wodnym jako nowy problem zdrowia środowiskowego Medycyna Środowiskowa – Environmental Medicine 18(1), 2015, 62-69

[4] I. Baranowska, B. Kowalski. Using HPLC Method with DAD Detection for the simultaneous determination of 15 drugs in surface water and wastewater. Polish Journal of Environmental Studies 20, 2011, 21-28.

[5] Council Directive 98/83/WE of 3 November 1998 on the quality of water intended for human consumption. Official Journal of the European Communities, 1998, L 330, 32-54.

[6] Commission Directive (EU) 2015/1787 of 6 October 2015 amending Annexes II and III to Council Directive 98/83/EC on the quality of water intended for human consumption. Official Journal of the European Union, 2015, L 260, 6-17.

[7] Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 7 grudnia 2017 r. w sprawie jakości wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi (Dz.U. z 11.12.2017 r., poz. 2294).

[8] The Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals 14th edition, Published by Merck Research Laboratories, Merck & Co., Inc., 2006, monograph 851, p. 140.

[9] The Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals 14th edition, Published by Merck Research Laboratories, Merck & Co., Inc., 2006, monograph 8332, p. 1438.